乳鼠心肌细胞培养方法详述

2019-08-21 05:57 来源:未知

核心提示: 日本一个研究小组日前宣布,他们开发出了利用诱导多功能干细胞高效培养心肌细胞的方法,今后如果能够利用这一方法大量培养心肌细胞,将可用于恢复因心肌梗塞而受损的心脏功能。

核心提示:一.材料所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。试剂 Trypsin, SDS, DMEM 均购一.材料所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。试剂 Trypsin, SDS, DMEM 均购于 Sigma Chemical Co.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司,其余均为国产分析纯。取鼠:标准SD大鼠,鼠盆用棉铺好,取鼠。物品:白大衣、饭盒小剪子、小镊子(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎心脏)瓶皿[两个小圆培养皿,培养皿内加DMEM液,先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴,事先加好水,最好是一或二蒸] [一个装0.1%新洁尔灭150ml左右,消毒小鼠]500ml烧杯1个,用作废液缸。50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液)三角烧杯 小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压)离心管及帽,两个试管吸管 大镊子 (两把,持物,例夹棉球等)台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沫塑料板、五个针头75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶、温度计、 PH试纸、酒精灯、打火机/火柴、载玻片[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml 2个20ml备用 2个、微量加样器 1000ml及500ml 以上物品均用紫外线照30分钟。另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入,后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开,把瓶皿摆好,再用一个瓶皿装酒精棉球。二.培养方法:事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用,提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭泡纱布(用10ml5%的新洁尔灭加水至500ml即得),消毒地面(1:500的84液),用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。具体方法为:1. 把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中,分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠,放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上,用针头把鼠固定,用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤,再用酒精棉球脱碘,取一把小剪子及小镊子开皮,充分撕拉开,再用酒精棉球消毒,后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。2. 取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。(鼠全部杀死后,把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁,铺纱布、换手套。3.用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉,放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶,然后将其中少许放入50ml的小烧杯中,大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块,倒入三角烧瓶中,再用剩余胰酶刷净烧杯。4.把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中,(事先调好水量,多会没过三角烧杯,少温度会不均匀)。打开磁力搅拌器电源,调温度(使-缓慢加到34~35℃)和转速(转速不可过快,否则会打碎细胞,基本上标志为平行)。一定要注意监控。5.温度达到34℃时开始计时,第一次为10分钟,以后可为8分钟,事情况而定。在此期间,在试管架上摆上5、6个离心管,标上1、1,2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升6.10 分钟后,把三角烧瓶取下,磁力搅拌器关上,用一个吸管轻轻吹打(使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来),这个吸管用后固定放在一个离心管中,以后每次消化后取下都用其吹打几下,第一次上清弃去,然后向两个1号管分别倒入2ml上清(尽量不要把组织倒出,也不要剩液太多,以免消化下的细胞重复消化造成损伤),用另一个吸管混匀配平两个管(即两个管水平高度相同),轻轻吹打,以免损坏细胞。7.接着把这两个离心管放入离心机中,调10分钟,800或1000转,打开关。8.同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶,继续消化8分钟,注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。9.取下三角烧瓶,仍用1号吸管吹打,后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清,取出两个离心后的1号管,把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉,后向其中一管加入4ml的DMEM液,用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中,把管底的沉淀细胞洗下来,把液体全部移入其中一管,三个管(1个1号管,两个2号管)配平,放入离心管中,离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶,放入三角烧瓶中,继续消化(注意控制温度,达34℃时计时)。10.消化到4次左右,吹打均匀后,吸一滴滴在载玻片上,拿到镜下观察消化情况,决定消化次数。11.离心2次的吸管,放在试管架上,待离心过程全部完事后,把各管上清液倒掉,在各管加上3ml(不用精确,大致这样)DMEM液,记住共加入多少DMEM液的量,换吸管把各管底细胞块吸下吹打均匀后,移入50ml烧杯中,然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中,加入小牛血清及抗生素,换吸管吹打均匀。12.取出24孔培养板,一个人吹打,另一个人用加样器加药。封盖时过火,盖上盖,放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。(生物秀实验频道 www.bbioo.com)(24孔板,每孔最多加2ml,一般加液时每孔加1~1.5ml)三.讨论乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞,培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法,我们在试验中摸索到0.06%浓度的胰酶对细胞损害较小,比起一些文献记载的0.15%浓度有一定的优越性,但这个浓度消化所需时间较长,所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法,每次消化一些后,用吸管抽取出上清液,离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1 h, 除去成纤维细胞,达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别[1]。心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形,大约在一天左右基本贴壁,此时细胞伸出伪足,伪足在镜下为纤维状条索,细胞胞体则呈现不规则形状,如多角形,部分细胞有聚集倾向,细胞搏动效果较好,DMEM培养基在初始培养时为深红色,两天后变为淡黄色,应该是营养成分下降的表现,也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充[2]。我们也拍摄了很多细胞的图片,效果很清晰,但目前没有在手头上,以后有机会补上。四.参考文献1.Wang HX, Zhang WM, Sheng JZ, Wong TM. High carbachol increases the electrically induced [Ca2 ]I transient in the single isolated ventricular myocyte of rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997;319:91-92.Animal cell culture methods edited by Jennie P.Mather and David Barnes.--California:Academic Press,c1998.--xiv,368p.24cm SBN0124800408:CNY619.26

日本科学家发现增加心肌细胞方法

图片 1

日本产业技术综合研究所等机构最新发明了一种技术,可以简便快速且廉价地培养心肌细胞。

生技网资讯: 日本一个研究小组日前宣布,他们开发出了利用诱导多功能干细胞高效培养心肌细胞的方法,今后如果能够利用这一方法大量培养心肌细胞,将可用于恢复因心肌梗塞而受损的心脏功能。

日本庆应义塾大学教授福田惠一和助教下地显一郎近日发现,一种名为“粒细胞集落刺激因子”的物质可以帮助心肌细胞大量增殖。

早期发育的细胞群虽然不能分化为心房细胞,但能够分化成心室细胞。这项研究由西奈山伊坎医学院明迪奇儿童健康和发展研究所的研究人员完成,并发表在了《自然

日本产业技术综合研究所和筑波大学、庆应义塾大学组成的联合研究小组发现,一个名为“Tbx6”的基因能够从纤维芽细胞直接诱导培养出心脏中胚层细胞。中胚层细胞可以分化为心肌细胞、心脏血管细胞等几乎所有的心脏构成细胞。

京都大学iPS细胞研究所副教授山下润率领的研究小组,向实验鼠的iPS细胞加入环孢菌素A后进行培养,发现发育成的心肌细胞数量是不加入环孢菌素A时的约12倍。而利用人类iPS细胞进行培养时,在培养到第12天的时候,确认生成的心肌细胞数量,是不加入环孢菌素A时的4倍以上。

老鼠胎儿在发育初期,心肌细胞会迅速增殖。福田对在母鼠子宫中发育了10天的老鼠胎儿进行了专门研究。他发现,这一时期老鼠胎儿体内的“粒细胞集落刺激因子”数量增加,于是猜测这种因子与心肌细胞增殖相关。

  • 通讯》杂志上。

研究还发现,将这个基因导入实验鼠胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞等多功能干细胞,也能高效培养出心脏中胚层细胞,并诱导分化出心肌细胞和心脏血管细胞等。

研究小组认为,这表明环孢菌素A在诱导实验鼠和人类iPS细胞发育成心肌细胞过程中发挥了重要作用。

为了证明这一猜测,福田利用胚胎干细胞技术培育出了猴子的心肌细胞,然后加入“粒细胞集落刺激因子”,结果猴子心肌细胞的数量增加了数十倍。这一成果发表在最新一期美国《细胞—干细胞》(Cell Stem Cell)杂志上。

根据美国卫生和人类服务部的数据,先天性心脏病是最常见的出生缺陷类型,每年在美国有 35000 名婴儿患有此病。大多数情况都是在发育过程中心室发育不全所致。虽然人们对心脏整体的发育研究很多,但对 4 个心腔的发育却缺乏深入的了解。

研究小组称,新技术克服了以往培养心肌细胞工序繁复和低效、不稳定的缺点,而且大大降低了培养成本,将有望应用于治疗心肌梗死和扩张型心肌病等心脏疾病的再生医疗和新药研发中。这一研究成果已在线发表在美国《细胞—干细胞》杂志上。

研究小组确认,利用人类iPS细胞培养的心肌细胞与人类心脏心室细胞拥有同样的性质和结构。相关论文已刊登在新一期美国科学杂志《公共科学图书馆·综合》网络版上。

此前,科学家已经发现,“粒细胞集落刺激因子”可以刺激骨髓产生大量白细胞,用于治疗由化疗导致的白细胞减少。福田指出,这次的成果可能会把“粒细胞集落刺激因子”进一步推向再生医疗的前台。

研究人员利用了小鼠细胞谱系的模型对 Foxa2 蛋白编码基因进行了研究,这种基因与胚胎形成时内胚层和外胚层的发育有关。他们发现了一种早期发育时会分泌 Foxa2 的祖细胞群,这些细胞可以发育分化为左、右心室细胞,但却不能发育为心房细胞。这项研究提示房室分离早在心脏结构分化形成时就出现了。

关键字:心肌细胞 细胞培养

《细胞—干细胞》发表论文摘要

“对于心腔形成的深入理解可以使我们更好的解释心脏缺陷的生理学原理,从而让我们能发现针对性的治疗手段。”西奈山伊坎医学院发育与再生专业,细胞分部助理教授、首席研究员妮可杜波依斯博士说,“除了帮助我们理解心脏的发育过程,我们希望这些发现能够引导我们针对心室细胞的培养进行更深入的研究,在未来这可能成为一种新的治疗手段。”

特别声明:本文转载仅仅是出于传播信息的需要,并不意味着代表本网站观点或证实其内容的真实性;如其他媒体、网站或个人从本网站转载使用,须保留本网站注明的“来源”,并自负版权等法律责任;作者如果不希望被转载或者联系转载稿费等事宜,请与我们接洽。

TAG标签:
版权声明:本文由开户免费送体验金38元发布于开户送38体验金不限id,转载请注明出处:乳鼠心肌细胞培养方法详述